pHBAAV-SaCas9-gRNA操作手册

相关Adeno-Associated Viral VectorAAV简介

腺相关病毒属微小病(parvovirus),为无包膜的单链线状DNA 病毒。AAV的基因4700bp,包括上下游两个开放读码框(ORF),位于分别由145 个核苷酸组成的2 个反向末端重复序列(ITR)之间。AAV基因组中有3 个启动子(P5P19P40)2个开放阅读读(ORF)rep cap,如图1,它们在AAV 病毒整合、复制和装配中其重要作用。

相关优点

1.  高:迄今从发现野生型AAV对人体致病,重组AAV基因组序列上去除了大部分的野生型AAV 基因组元件,进一步保证了安全性;

2.  性低AAV2的基因组仅4681个核苷酸,便于用常规的重组DNA技术进行操作,而且进行动物实验时造成的免疫反应小;

3.  宿围广感染分裂细胞和非分裂细胞;

4.  表达稳定:的长表达;

5.  定:在60℃不能被灭活,能抗氯仿;

 

CRISPR/Cas9 基因敲除原理

CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA 或其他外源DNA 的免疫机制。IICRISPR/Cas系统在发挥功能时仅需要一种蛋白即Cas9核酸酶参与。Cas9核酸酶复合体由Cas9蛋白和两个非编码的RNA-crRNA前体pre-crRNAtracrRNA组成。在酿脓链球菌(Streptococcus pyoge nes), pre-crRNAtracrRNA均由CRISPR上转录而来, 然后pre-crRNA通过其含有的重复序列和tracrRNA形成RNA异二聚体, 并结合到Cas9蛋白上, Cas9蛋白再对pre-crRNA进行剪切以获得成熟的crRNA, 成熟的crRNA上长度为20个碱基的向导序列通过与目的DNA的序列互补来引导整个Cas9复合体去切割目的DNA。除了成熟的crRNA上的向导序列外, Cas9识别的DNA位点的3’,还必须有一个PAM(protospacer adjacent motif)区域。而Cas9识别位点的特异性就由20个碱基的向导序列和3个碱基的PAM序列共同决定。一旦基因组序列中出现由于gRNA引导的Cas9切割DNA断口,细胞内的非同源末端连接修复机制和同源重组修复机制就会启动,而非同源末端连接修复机制会造成基因组序列的突变和移码,从而有一定概率出现目的基因的序列突变和蛋白翻译提前终止。

 

 

2. Crispr/Cas9系统示意图

 

四、pHBAAV-SaCas9-gRNA基因元件示意图

 

SaCas9staphylococcus aureus cas9)来自金黄色葡萄球菌,基因长度由经典的spCas9Streptococcus pyogenes)的4400bp缩短为3300bp,基因大小大幅减少了25%SaCas9可以被装载进入腺相关病毒(AAV)而不影响AAV的包装和活力,因此提供了一个非常方便有效的在体基因操作工具。

 

3. pHBAAV-SaCas9-gRNA示意图

 

五、sgRNA设计及pHBAAV-SaCas9-gRNA载体构建 

1.Human TRF3基因为例进行说明

 

CDS区(灰色标记为第一外显子,黄色标记为第二外显子):

 

2. SaCas9-gRNA设计原则:

2.1  SaCas9识别的PAM区为NNGRRTNNGAATNNGAGTNNGGATNNGGGT),NNGRRN也可以,对于sgRNA的长度,一般应21或者22 nt

2.2   sgRNA序列的碱基组成,要避免序列中含“TTTT”终止信号,其中GC%含量最佳为40%~60%

2.3  如果sgRNAU6T7启动子驱动表达的,要考虑sgRNA5' 碱基为GGG,以提高其转录效率;

2.4  对于sgRNA靶向基因的结合位置,如需造成基因移码突变,需尽量靠近基因编码区的ATG游,最好位于第一或第二外显子;

2.5  检查sgRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs

2.6  对于Cas9单切口酶,设计paired-gRNA时需考虑成对sgRNA的间距;

2.7  全基因脱靶效应分析,需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数,建议最少5个碱基。重点考察种子序列和非种子序列碱基错配数,以及脱靶位点是否位于基因编码区等,另外还可考察是否存在碱基插入或缺失的脱靶位点。

 

3SaCas9-gRNA序列设计:

基于以上原则:最终确定的gRNA打靶序列为:

SaCas9-gRNA1T:  5’ CACCGGACCCCTATTTCAGAATGTTG 3’(正义链)

SaCas9-gRNA1B:  5’AAACCAACATTCTGAAATAGGGGTCC3’

SaCas9-gRNA2T:  5’ CACCGGTCATTGGTGTCATGGGAGTT3’反义链

SaCas9-gRNA2B:  5’AAACAACTCCCATGACACCAATGACC3’

SaCas9-gRNA 3T:  5’ CACCGGCTGGACTGAGTCAGTATCAC 3’反义链

SaCas9-gRNA3B:  5’AAACGTGATACTGACTCAGTCCAGCC3’

 

4 pHBAAV-SaCas9-gRNA载体构建

4.1  将合成的配对gRNA序列退火成双链;

4.2  PHBAAV-SaCas9-gRNA载体采用BsaI酶进行酶切和胶回收;

4.3  将退火的sgRNA与酶切好的PHBAAV-SaCas9-gRNA载体用T4连接酶连接;

4.4  测序确认sgRNA序列插入正确。

 

六、pHBAAV-SaCas9-gRNA病毒包装及滴度测定

详见汉恒生物AAV病毒技术手册

 

七、pHBAAV-SaCas9-gRNA打靶验证

1:将293T细胞平铺到12孔板,待细胞密度达到40%-60%PHBAAV-SaCas9-gRNA病毒感染293T细胞

2:感染24h后换液,96h后收集细胞,提取基因组,用打靶序列两端的引物进行PCR,将PCR产物送测序,通过PCR是否在打靶位置出现测序套峰确定是否存在敲除效果

 

八、pHBAAV-SaCas9-gRN打靶效果:

 

1. pHBAAV-SaCas9-gRNA1感染的细胞基因组测序确认在打靶位置周围出现套峰,存在打靶效果。

 

 

 

 

2. pHBAAV-SaCas9-gRNA2感染的细胞基因组测序确认在打靶位置周围出现不明显套峰,打靶效果有待进一步确认。

 

 

3. pHBAAV-SaCas9-gRNA3感染的细胞基因组测序确认在打靶位置周围出现非常明显套峰,打靶效果很好。

 

九、结论

1. 结果表明,pHBAAV-SaCas9-gRNA3293细胞中的TRF3基因打靶效果比其他两条gRNA序列构建的AAV病毒明显。

2.本结果只证明pHBAAV-SaCas9-gRNA载体的有效性,如需筛选TRF3基因的敲除细胞株,需进一步进行单克隆细胞培养和测序筛选出现近起始密码子移码突变单克隆细胞株。

 

 

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